整合空间转录组和代谢研究揭示人脑损伤后的代谢异质性

空间转录组学揭示损伤脑的独特分子区域化

为了探索TBI的细胞景观，研究人员收集了TBI患者手术后的脑挫伤组织，并基于10× Genomics进行单细胞RNA测序(RNA-seq)。细胞经过t分布随机邻居嵌入(tSNE)分析，在两组中获得了10个簇(图1A)。细胞注释识别了10个簇，分别为B细胞、内皮细胞、颗粒细胞、小胶质细胞、壁细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、少突胶质细胞和T细胞(图1B)。此外，在研究信号通路时，KEGG分析显示，重度TBI中上调的基因主要富集在感染和免疫状态，包括Th1、Th2和Th17分化以及抗原加工和呈递(图1C)，而下调的基因则富集在神经炎症，如肿瘤坏死因子(TNF)信号、白细胞介素17(IL-17)、HIF-1 和核因子κB(NF-κB)信号(图1D)。

由于研究人员发现中度和重度脑损伤之间存在不同的细胞簇，这促使研究人员通过使用Visium(10× Genomics)平台处理新鲜手术样本的空间转录组(ST)，来表征受损大脑的转录组景观。在过滤出线粒体蛋白编码基因后，结果数据集由4,000个单独的点组成，平均每个点约有2,500个基因和7,500个独特的转录本。首先，研究人员使用统一流形近似和投影(UMAP)对空间转录组数据集进行反卷积，以进行降维，以可视化簇13(图2A)。研究人员确定了10个组织学上可辨认的基本结构转录组景观。对每个因子的顶级贡献基因的分析证实了这些簇的身份及其混合特征(图2B)。

为了更好地可视化中度和重度TBI的分子区域化，研究人员添加了胶质瘤和脑膜瘤样本作为参考(图s2A和2B)，这些样本在STAR方法中进行了描述。根据ST表达，胶质瘤和脑膜瘤组织分别富集(簇3和4)。在驱动胶质瘤簇3的基因中，研究人员发现SLC47A2、C11orf88、MAP3K19和ADGB在胶质瘤组织中高表达，PRG4、BMP5、SIX2和FOXD2在脑膜瘤组织中增加。由于这些基因以前没有被描述为损伤脑室的标志物，研究人员使用ST验证这些基因的区域特异性mRNA表达。因此，ST分析区分了中度和重度脑损伤之间的细胞室分层，这在几乎所有簇中都很明显(图3A和3B)。研究人员进一步应用addmodulescore绘制ST图像中的细胞簇，发现中度和重度TBI之间小胶质细胞、NK细胞、T细胞和少突胶质细胞的分布不同(图3C-3F)。

可视化脂质过氧化和代谢基因相关的神经元丢失

然后，研究人员用GO和KEGG做了通路富集分析。研究人员发现上调的基因富集在髓鞘化、微管蛋白结合、tau蛋白结合、花生四烯酸代谢和脂质代谢(图3G和3H)，而下调的基因主要在糖酵解过程、糖皮质激素受体结合、谷氨酸代谢和糖异生(图3I和3J)。这导致研究人员研究TBI后的代谢变化。传统的代谢研究没有显示空间位置和异质性；

因此，研究人员应用了空间代谢分析。因此，研究人员对空间代谢图像在UMAP后使用K-means聚类分析，发现这些聚类与ST数据相当一致(图2C)。然后，研究人员应用PLSDA评估组分布，研究人员发现中度和重度TBI组都可以明显分开(图2D)。接下来，研究人员检查了研究人员的数据集在组织内解决代谢变化(如过氧化)的能力。研究人员观察到S1PR5和SEPTIN4中代谢相关基因的富集(图4A和4C)，它们主要表达于具有相对较小异质性的重度TBI组。在将这些基因映射到代谢图像上后，研究人员观察到S1PR5定义了类似于高PC(44:7)的结构，PC(44:7)是一种脂质标志物，被称为脂质过氧化(图4B)。相比之下，SEPTIN4定义了神经元损失区域(图4D)，SEPTIN4表达较高，并以天冬氨酸分布较低为特征(图4D)。

先前也有报道指出肌醇(MI)在脑损伤中增加。研究人员进一步研究了MI的分布，发现MI和MI 1-磷酸的补体表达，其中MI区域的表达较高，MI 1-磷酸的分布较低，反之亦然(图5D和5F)。由于MI的分布与ST簇1和8相当一致，在簇1和8中发现的顶级基因中，研究人员发现SLC5A3(也称为钠/MI交换转运蛋白1)在中度TBI组中高表达，在重度TBI组中高表达，在重度TBI组中高表达。TBI组(图5A-5C)和SLC5A11(也称为钠/MI交换转运蛋白2)在重度TBI组中高表达(图5E、5G和5H)，这与MI和MI 1磷酸盐分布一致。

研究人员先前报道过，红藻氨酸可以诱导啮齿动物海马神经元丧失和增加mINS水平，这是癫痫持续状态(post-status epilepticus, postSE)的模型。再次，研究人员发现，与磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)治疗的大鼠相比，红藻氨酸(KA)治疗的大鼠NAA/Cr降低，mINS/Cr升高(图6A-6D)。此外，免疫组化(IHC)图像证实了大鼠损伤脑组织中S1PR5和SEPTIN4的蛋白表达增加(图6E)。同样，大鼠损伤脑组织中SLC5A3和SLC5A11的表达也通过IHC验证(图6E)。

通路分析证实，中度和重度TBI组之间差异表达的基因与细胞杀伤和代谢相关(图6F和6G)，而GO富集表明细胞杀伤和抗氧化活性相关(图6F)。有趣的是，KEGG通路定义了一系列代谢，其特征是外源生物降解、萜类、维生素、脂质代谢、聚糖生物合成、能量代谢、碳水化合物和氨基酸代谢(图6G)。由于差异表达基因(DEGs)与细胞死亡、抗氧化活性和脂质代谢相关，因此有理由认为空间基因簇可以作为受损大脑进一步代谢变化的解码器。

空间转录组与代谢物之间的联系

针对代谢物的具体定量指标，研究人员研究了SLC5A3、SLC5A11与MI水平的线性关系。首先，研究人员通过feature plot和violin plot展示了SLC5A3和SLC5A11的细胞定位。
SLC5A3主要表达于内皮细胞，而SLC5A11表达于少突胶质细胞、内皮细胞和免疫细胞(图7A-7D)。同时，从GeneCard网站得知SLC5A3和SLC5A11都是肌醇和葡萄糖的转运体，SLC5A11与细胞凋亡相关。
研究人员进一步获得了这两个基因的spot值，并比较了中度和重度TBI组之间的各表达量(图7E和7F)。研究人员发现，与中度TBI组相比，重度TBI组的SLC5A3相对表达量较低，而SLC5A11的表达量则较高(图7G和7H)。研究人员还研究了SLC5A3、SLC5A11与不同代谢物之间的线性关系。研究人员仅发现SLC5A11与MI水平和PC(44:7)水平呈正相关，这可能也是由于样本量小所致(图7I-7P)。

由于研究人员发现损伤脑组织中存在异质性转录组和代谢物，因此研究人员进一步研究了它们与基于不同代谢物的通路富集分析之间的联系。
研究人员根据不同的代谢物手工绘制了感兴趣区域(ROI)，并首先比较了高PC和低PC区域之间的差异表达基因，发现差异表达基因的富集通路主要集中在突触减少和神经元投射上，这表明脂质过氧化可能对突触形成和神经元发育有影响(图S1)。然后，研究人员将代谢图中的同一区域与空间转录图进行交叉，结果显示SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4在重度TBI组中的表达增加(图S2A)。上调基因富集于醚脂代谢和组氨酸代谢(图S2B)，而下调基因富集于突触、神经元细胞体和ATP活性(图S2C)。研究人员进一步对重度和中度TBI之间的平均PC(44:7)水平进行了聚类。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示了聚类样本的分布(图S2D)。为了避免过拟合，PC (44:7)模型通过7倍交叉验证和200次响应排列检验进行验证(图S2E)。对于这些差异基因的富集通路，它们大多富集在代谢通路中：亚油酸代谢、不饱和脂肪酸、半乳糖代谢、咖啡因代谢、谷氨酸和甘油磷脂代谢以及牛磺酸和蛋氨酸代谢。这些结果表明，ST中差异基因的富集通路与空间代谢图中的KEGG结果相当一致(图S2F)。

然后，研究人员比较了高和低天冬氨酸组，发现DEGs也富集在突触活性降低，同时激活了陈旧轴突、突触囊泡和轴突发生(图S3)。再次，研究人员从代谢图到空间转录图的相同区域，显示SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4的表达在重度TBI组中增加(图S4A)。
上调基因富集在髓鞘化、髓鞘、磷脂酶D信号通路和醚脂代谢(图S4B)，而下调基因富集在突触、ATP代谢过程和神经退行性疾病通路(图S4C)。研究人员进一步对重度和中度TBI之间的平均天冬氨酸水平进行了聚类。OPLS-DA显示了聚类样本的分布(图S4D)，并通过7倍交叉验证模型进行了验证(图S4E)。对于这些DEGs的富集通路，它们中的大多数富集在代谢通路(图S4F)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；亚油酸代谢；半乳糖代谢；咖啡因代谢；谷氨酸、牛磺酸和蛋氨酸代谢。
这些结果再次表明，ST中DEGs的富集通路与空间代谢图中的KEGG结果相当一致。
对于磷酸化MI和MI的比较，富集通路是髓鞘形成减少和轴突和神经元部分活化，这表明磷酸化MI(pMI)和MI在髓鞘形成中具有重要作用(图S5)。再次，研究人员从代谢图到空间转录组图的相同区域，显示SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4的表达在重度TBI组中增加(图S6A)。上调基因富集于髓鞘形成、髓鞘和胶质形成(图S6B)，而下调基因富集于突触、ATP代谢过程、神经退行性变和突触传递通路(图S6C)。然后，研究人员对重度和中度TBI之间的平均p-MIS/MIS水平进行了聚类。OPLS-DA显示了聚类样本的分布(图S6D)，并通过7倍交叉验证模型进行了验证(图S6E)。关于p-MIS/MIS的富集通路，研究人员发现，在重度TBI组中，p-MIS/MIS的富集通路与p-MI/MI的富集通路相似，但差异无统计学意义(图S6C)。DEGs，其中大部分富集在代谢途径中(图S6F)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；精氨酸生物合成；中心碳代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；烟酸和烟酰胺代谢；半胱氨酸apaminoacyl-tRNA-生物合成。这些结果再次表明，ST中DEGs的富集途径(图S6F)与空间代谢图中的KEGG结果(图S5F)非常一致。